在1508年写给朋友的一封信中，米开朗琪罗承认他不喜欢绘画，而且很不愿给西斯廷教堂（Sistine Chapel）画天顶画。但是，他所画的西斯廷教堂的天顶却成了世界上最著名的天顶之一。教堂位于罗马教皇的正式居所——梵蒂冈，以教皇西斯笃四世（Sixtus IV）命名，特意按所罗门圣殿的规模设计，建于1475—1481年间。教堂内部墙壁上布满了基督教主题的壁画。教皇尤利乌斯二世（Julius II）亲自点名要求米开朗琪罗来绘制教堂的天顶。据传言，艺术家在不情愿地同意之后，把自己在教堂里关了四年，不允许任何人进来。但是这部分故事估计是编造的，因为米开朗琪罗肯定需要工作室的学徒们帮忙，才能在四年内完成这个项目。

不过，西斯廷教堂墙面的壁画不是米开朗琪罗绘制的，而是桑德罗·波提切利和米开朗琪罗曾经的师父多米尼科·基尔兰达约（Domenico Ghirlandaio）等其他艺术家的作品。壁画描绘了圣经中的故事和场景，包括摩西的故事和基督的一生。在天顶画中，米开朗琪罗绘制了很多《旧约》中的场景，包括“大卫与歌利亚”“创造亚当”“逐出乐园”和“朱迪斯与赫罗弗尼斯”（Judith and Holofernes）等。西斯廷教堂里画着几百位不同姿态的人物、各式各样的不同场景、植物、自然风景和立体的建筑元素，很容易显得繁复冗余。但是米开朗琪罗让整个13米x 39米的空间变得优美、平静、令人心生敬畏。